HPLC analizlerinizde "bu pik şekillerde bir gariplik var" diye düşündüğünüz oldu mu hiç? Rutin analiz çalışmaları yaparken anormal pik şekilleri sık karşılaşılabilen bir sorundur. Kromatogramlarda açıkça görülebilen pik anormallikleri, Şekil 1'de gösterildiği gibi pik genişlemesi (aşırı kuyruklanma veya ön kenarlar da dahil), pik omuzlanması ve pik bölünmesi gibi durumları içermektedir.
 

 
Şekil 1. Anormal Pik Şekilleri
 
Kromatogramlarda ortaya çıkabilen bu pik anormallikleri Şekil 2'de belirtilen faktörlerden kaynaklanabilir. Bu makalede, anormal pik şekillerin başlıca nedenleri tartışılmaktadır.


Şekil 2. Anormal Pik Şekillerinin Başlıca Nedenleri
 

Kolonun Bozulması

• Eğer analiz koşulları her zamankinden farklı olmadığı halde elde edilen pik şekilleri Şekil 1'de gösterilenlere benzemeye başlarsa, bunun en olası nedeni kolon bozulmasıdır (kirlenme dahil). Analitik kolonun önüne bir guard kolon takılmışsa, guard kolonu çıkardıktan sonra pik şeklini kontrol edin. Pikler normale dönerse, sorun guard kolonla ilgilidir.
• Kolonun bozulması dolgu maddesindeki bir değişim, kirletici bileşenlerin birikmesi, mikropartikül blokajı, katı fazdan desorpsiyon veya diğer faktörlerden kaynaklı olabilir. Dolgu maddesinin durumu uzun süreli basınç yüklerine maruziyet veya dolgu maddesinin bozulması (silika jelin çözünmesi vb.) gibi nedenlere bağlı olarak değişebilir. Birçok durumda, kolon girişindeki dolgu maddesinde hafif bir boşluk gelişir ve bu da pik omuzlanmasına veya bölünmüş piklere neden olabilir. Mikropartikül blokajı (numune çözeltilerinden, mobil fazlardan, pompalardan, numune enjeksiyon ünitelerinden, vb.) veya kirletici bileşenlerin birikintileri, kolonların girişlerine ya da girişin yakınındaki dolgu maddesine takılan filtrelerde meydana gelebilir. Numune bileşenlerin akışını engelleyen mikropartiküller veya kirletici birikimlerine numune bileşenlerinin adsorpsiyonu, pik şekillerini değiştirebilir. Katı fazdan gelen desorpsiyon sadece pik şeklini değiştiremez, aynı zamanda alıkonma sürelerini de kısaltabilir.
• Kolon bozulmasından şüpheleniliyorsa, kolonu yıkayın. Kolon yıkama yöntemleri ile ilgili talimatlar için kolon kullanım kılavuzundan yararlanabilirsiniz. Yıkamadan sonra beklenen sonuçlar elde edilemiyorsa, kolonlarda backflush yöntemi denenebilir. (Yıkama çözeltisi, kolon çıkışından kolonun içinden geçecek şekilde düşük bir akış hızında zıt yönde pompalanır.) Burada dikkat edilmesi gereken hususlardan biri backflush işlemi öncesinde, kolonun backflush için uygun olduğunu kolon kullanım kılavuzu veya farklı kaynaklardan teyid edilmesi gerekliliğidir. Yıkama veya backflush problemi çözmezse, kolon kullanım ömrünü tamamlamış demektir.

Numune Solventi Seçimi veya Enjeksiyon Hacmi ile İlgili Hatalar  

• Burada, ön işlem veya analiz edilen maddenin konsantrasyonu nedeniyle numune solventi bileşiminin veya enjeksiyon hacminin değiştirilmesinden sonra anormal pik şekillerinin meydana geldiği durumlar kastedilmektedir. Bu gibi durumlarda, yapılacak ilk iş, bir önceki numune solventi ve enjeksiyon hacmi kullanılarak pik şeklinin onaylanması olmalıdır.
• Numune solventi bileşiminin pik şekli üzerindeki etkilerinin örnekleri Şekil 3'te gösterilmiştir. (a) ve (b) kromatogramları, iki farklı türde solvent kullanılarak hazırlanan standart karışım solventlerinin aynı cihazda analizinden elde edilen sonuçlardır.

Kromatogram (b) tek başına görüntülendiğinde fark edilmemesine rağmen, kromatogram (a) ile yapılan bir karşılaştırma, kromatogram (b)’de pik genişlemesi olduğunu açıkça göstermektedir. Kromatogram (a), mobil faz (sitrat tampon çözeltisi / asetonitril = 3/1) ile aynı organik solvent oranındaki numune solventi (su / asetonitril = 3/1) ile yapılan çalışmayı, kromatogram (b) ise ters faz modu için son derece güçlü bir solvent olan asetonitrilin numune solventi olarak tek başına kullanıldığı çalışmayı göstermektedir. Bu örnek, güçlü solventlerin numune solventindeki oranı yükseldikçe, pik şeklinin nasıl etkilenebileceği görülmektedir.

Şekil 3. Numune Solventlerinin Pik Şekilleri Üzerine Etkileri

• Numune enjeksiyon hacmi, kolonda ayrımın ilk aşamasında numune bölgesinin genişlemesine ile ilgilidir. Bu nedenle, enjeksiyon hacminin arttırılması pik genişlemesine neden olabilir. Güçlü solventin numune solventi içindeki oranı ne kadar yüksek olursa, etkisi de o kadar büyük olur.

Akış Hatlarındaki Ölü Hacimler

• Farklı (ancak aynı iç çapa sahip) tubingler kullandıktan sonra pikler genişlerse, bu durum tubing bağlantılarındaki (numune enjeksiyon ünitesi, kolon ve dedektör arasında) ölü hacminden numunelerin geçmesine bağlı olabilir. Şekil 4'te, bir ölü hacim örneği gösterilmektedir.

Şekil 4. Akış Hattı Bağlantısındaki Ölü Hacim

• Konektörden çıkan tubing’in uzunluğu, üreticiye bağlı olarak değişir. Bu uzunluk kolon bağlantıları için özellikle önemlidir. Yeni tubing takılmışsa, tubingi sonuna kadar sokun ve konektör sıkılırken uzak tarafa doğru bastırın.

Kolonlardaki Sıcaklık Gradiyentleri

• Yüksek akış hızları, yüksek kolon sıcaklıkları veya büyük bir iç çapa sahip bir kolon kullanılıyorsa ve mobil faz yeterince ısıtılmadan kolondan akıyorsa, kolonun enine kesit yönünde bir sıcaklık gradiyenti oluşabilir. (Kolonun ortasındaki sıcaklık, kolon iç duvarlarının yakınındaki bölgelere göre daha düşüktür.) Bu durum pik genişlemesine neden olabilir.
• Sıcaklık gradiyenti etkilerini, kolon fırınındaki mobil fazın ön ısıtılması için numune enjeksiyon ünitesi ve kolon arasındaki (paslanmaz çelik) tubinglerin uzatılmasıyla, azaltmak mümkündür. Bununla birlikte, bu aynı zamanda, ön ısıtma tubing’inde pik genişlemesine de neden olabilir. Bu durumda iç çapın ve uzunluğun optimize edilmesini gerekmektedir.

Dedektör Sinyali Ayarının Uygun Olmaması

• Gürültü, dedektör sinyali ayarı değiştirilerek (zaman sabiti olarak da adlandırılır) azaltılabilir. Daha yavaş bir sinyal ayarı gürültüyü azaltabilir, bu da yüksek hassasiyetli analizler için yararlıdır, ancak aynı zamanda pik genişlemesi ile sonuçlanır. Sinyalin pik şekillerine etkilerinin örnekleri Şekil 5'te gösterilmektedir.

Şekil 5. Sinyalin Pik Şekillerine Etkileri

• Şekil 5, pik elüsyonu ne kadar erken olursa, pik şeklinin sinyal ayarlarından o kadar fazla etkilendiğini göstermektedir. Bu nedenle, bir önlem olarak, analize başlamadan önce sinyal ayarının kontrol edilmesi yerinde olacaktır.

Referans: https://www.shimadzu.com/an/support/lib/lctalk/92/abnormalpeakshapes.htm