Otomatik Western Blot İşleme

Western blot işleme prosedürü, çok sayıda yıkama ve antikor inkübasyonu içeren uygulamalı, zahmetli bir işlemdir. Bu kadar çok adımla, özellikle bir seferde birkaç leke işleniyorsa, bir western blot işlenirken diğer çalışmalara veya deneylere odaklanmak zordur. Genellikle, belirli bir protokol ve reaktifler, ilgilenilen bir protein için optimize edilir. Bandmate Otomatik Western Blot İşlemcisi hiçbir özel reaktif gerektirmez ve mevcut western blot protokollerinize uyacak şekilde programlanabilir. Bandmate cihazını, blot işleme için mevcut reaktiflerinizi ve protokollerinizi kullanarak dört adede kadar blotu işleyecek şekilde ayarlamak için minimum çaba gerekir, ancak çok daha kısa uygulama süresi ile.





 

Basit ve güvenilir çalışma ile, aşağıdakiler için ayarlamalar dahil olmak üzere, inkübasyon adımlarının zamanlamasını normalde yaptığınız gibi programlayın:

• Dağıtma hacimleri - 75 mL'ye kadar (mini blotlar için) ve 150 mL'ye kadar (midi blotlar için); adım başına 10 tekrara kadar programlanabilir
• Sallanma hızları - dakikada 5 ila 40 devir
• İnkübasyon süreleri - gece boyunca veya daha uzun inkübasyonlar gerektirebilecek lekeler için 1 dakikadan 96 saate kadar
• İşleme sıcaklıkları - sistem gerekirse 4°C'lik soğuk bir odaya yerleştirilebilir—özel reaktifler gerekmez

Bandmate Otomatik Western Blot İşlemcisi ile işlenen mini lekeler, manuel işleme prosedürüyle işlenen lekelere kıyasla, çoklu problanmış hedefler arasında karşılaştırılabilir yoğunluk seviyeleri gösterir.














 

Thermo Fisher Scientific Invitrogen Bandmate Automated Western Blot Processor ile işlenen midi blotlar, manuel işleme prosedürüyle işlenen blotlarla karşılaştırıldığında, çoklu problanmış hedefler arasında karşılaştırılabilir yoğunluk seviyeleri gösterir.

Günden Güne ve Kişiden Kişiye Değişmeyen Tutarlılık

Blok, yıkama ve antikor inkübasyon adımlarının kesin zamanlamasını korumak, lekeden lekeye zor olabilir. Bandmate sisteminin işlem adımları programlanabilir olduğundan, manuel uygulamalı western blot işlemeye kıyasla adımların hassasiyeti geliştirilebilir. Daha kesin olarak, daha güvenilir sonuçlar için deneyden deneye tutarlılık da geliştirilmelidir.

Benekler Bandmate Otomatik Western Blot İşlemcisi ile işlendiğinde, proteinlerin saptanması lekeden lekeye tutarlıdır. 1.0 ug/uL'den başlayan 2 kat bir HeLa hücre lizatı seyreltme serisi hazırlandı, bir Novex %4-20 Tris-Glisin jeli (WXP42012BOX) üzerine yüklendi ve 225V'de yaklaşık 40 dakika elektroforezlendi. Jeller, iBlot™ 2 Transfer Yığınları (Cat. No. IB23002) kullanılarak nitroselüloz membranlara aktarıldı. Önceden ayarlanmış bir protokol izlenerek Bandmate Otomatik Western Blot İşlemcisi kullanılarak dört leke işlendi. Lekeler, 1X Blocker FL Floresan Engelleme Tamponunda (Kat. No. 37565) bloke edildi. Lekeler, aşağıdaki konsantrasyonlarda 1X Blocker FL Floresan Bloke Edici Tampon içinde seyreltilmiş bir birincil antikor karışımı ile problanmıştır: Rabbit Anti Hsp90 (1:5000) (Cat. No. PA1-013), Chicken anti-Calreticulin (1:4000) (Kat. No. PA1-903) ve Fare Anti P23(1:1000) (Kat. No. MA3-414). Bunu 1X Blocker FL: Goat anti-Mouse Alexa Fluor Plus 680 (Cat. No. A32729), Goat anti Chicken Alexa Fluor 546 (Cat. No. A11040) ve Goat içinde 1:5000'de seyreltilmiş ikincil antikorlarla inkübasyon izledi. anti Tavşan DyLight 800 4XPEG (Cat. No. SA5-35571). Blotlar, iBright FL1500 Görüntüleme Sisteminde görüntülendi.

Değerli Antikorların Korunmasına Yardımcı Olur

Bandmate Otomatik Western Blot İşlemcisi, saptama hassasiyetinde önemli bir kayıp olmaksızın mini leke başına 3.5 mL veya midi leke başına 7.5 mL kadar düşük birincil antikorla etkili olabilir. 4.0 ug/mL'den başlayan 2 kat bir HeLa hücre lizatı seyreltme serisi hazırlandı, mini jeller için bir Bolt %4-12 Bis-Tris-Plus jeli (NW04122BOX) ve NuPAGE %4-12 Bis-Tris-Plus üzerine yüklendi midi jeller için jel (WG1401BOX) ve yaklaşık 22 dakika boyunca 200V'de elektroforeze tabi tutulur. Jeller, Power Blotter System (Cat. No. PB0012) ve Power Blotter Select Transfer Stacks (Cat. No. PB3210) kullanılarak nitroselüloz membranlara aktarıldı. Bandmate Automated Western Blot Processor kullanılarak birincil antikor hacmi verimliliğini test etmek için, mini blotlar (3,5 mL, 5 mL ve 10 mL) için üç farklı birincil antikor hacmi ve midi blotlar (7,5 mL ve 15 mL) için iki hacim test edildi. . Blotlar, her bir hacim için uyarlanmış protokollerle işlendi. Lekeler, 1X Berrak Süt Bloke Etme Tamponunda (Kat. No. 37587) bloke edildi. Lekeler, aşağıdaki konsantrasyonlarda 1X Berrak Süt Bloke Etme Tamponunda seyreltilmiş bir birincil antikor karışımı ile problanmıştır: Fare Anti STAT3 (1:500) (Kat. No. MA1-13042), Fare Anti PDI (1:2500) (Kat. MA3-019) ve Tavşan Anti Siklofilin B (1:1000) (Cat. No. PA1-027A). Bunu, ikincil antikor Stabilize Keçi anti-Tavşan HRP 10 µg/mL (1:500) (Kat. No. 32460) ve Stabilize Keçi anti-Fare HRP 10 µg/mL (1:500) (Kat. 32430). Kemilüminesans tespiti için, lekeler SuperSignal West Pico Plus Substrate (Cat. No. 34577) ile inkübe edildi. Membranlar, iBright FL1500 Görüntüleme Sisteminde görüntülendi.

Bandmate Otomatik Western Blot İşlemcisi ile başlangıç antikor hacminin %90'ından fazlası toplanabilir ve gelecekte yeniden kullanım için geri kazanılabilir. Bununla birlikte, ardışık antikor yeniden kullanımları, hedef saptamada art arda düşüşlere yol açabilir ve son kullanıcı tarafından doğrulanmalıdır (not: ardışık antikor yeniden kullanımlarının bir sonucu olarak hedef saptama üzerindeki etki, antikordan antikora değişebilir).











 

Bandmate sistemi, ilgili inkübasyon adımlarından sonra birincil ve ikincil antikorları yakalama yeteneği sunar, böylece antikor çözeltileri gelecekteki deneylerde yeniden kullanılmak üzere kaydedilebilir. 4.0 ug/uL'den başlayan 2 kat bir HeLa hücre lizatı seyreltme serisi hazırlandı, bir Bolt %4-12 Bis-Tris-Plus jeli (NW04122BOX) üzerine yüklendi ve yaklaşık 22 dakika boyunca 200V'de elektroforezlendi. Jeller, Power Blotter System (PB0012) ve Power Blotter Select Transfer Stacks (Cat. No. PB3210) kullanılarak nitroselüloz membranlara aktarıldı. Antikor geri kazanımının doğruluğunu ve saptama etkinliğini test etmek için, birincil antikoru geri kazanmak üzere Bandmate Otomatik Western Blot İşlemci protokolü kuruldu ve aynı antikor üç kez kullanıldı. Lekeler, 1X Berrak Süt Engelleme Tamponu içinde seyreltilmiş Fare Anti PDI (1:2500) (Kat. No. MA3-019) ile problanmış, 1X Berrak Süt Engelleme Tamponu (Kat. No. 37587) içinde bloke edilmiştir. Bunu, 1X TBST içinde 1:5000'de seyreltilmiş ikincil antikor Goat anti-Mouse Alexa Fluor Plus 680 (Cat. No. A32729) ile inkübasyon izledi. Blotlar, iBright FL1500 Görüntüleme Sisteminde görüntülendi.

Bandmate Western Blot sistemi nasıl çalışır?

Blokaj tamponu, yıkama tamponu ve antikor solüsyonları normalde olduğu gibi hazırlanabilir. Çözeltiler hazırlandıktan sonra, yıkama tamponu, işleme prosedürü boyunca gerekli hacimlerde yıkama tamponu dağıtacak olan bir yıkama tamponu rezervuar şişesine eklenmelidir. Daha sonra, antikor çözeltileri Bandmate Reaktif Tüplerine yüklenir (her mini leke için minimum 3.5 mL birincil ve ikincil antikor çözeltisi veya her midi leke için 7.5 mL). Daha sonra, leke zarları, külbütör beşik çerçeveleri tarafından desteklenen ayrı numune tepsilerine yerleştirilir. Engelleme arabelleği doğrudan her tepsiye eklenir.













İnkübasyon adımlarından sonra antikor geri kazanımı isteniyorsa, hem birincil hem de ikincil antikoru ayrı ayrı yakalamak için atık tepsilerinin her iki tarafına antikor geri kazanım tüpleri (50 mL konik tüpler) yerleştirilebilir. Bandmate cihazı işleme için gerekli reaktiflerle kurulduğunda, önceden programlanmış protokoller, depolanmış özel protokoller veya yeni oluşturulmuş özel protokoller kullanılabilir. Program ayarlandıktan sonra, tüm işlem adımları, daha fazla girdi gerekmeden senkronize bir şekilde gerçekleştirilir - kurulum ve adım adım uzaklaşın.

Protokol ilerledikçe, kapalı tabanlı Bandmate Reaktif Tüpleri, antikoru doğrudan işleme tepsilerine iletmek için delinir. Reaktif tüpleri, gerektiğinde reaktif kaydırma çubuğu aracılığıyla içeri ve dışarı hareket eder. İnkübasyondan sonra, antikor atığa gönderilebilir veya atık ve geri kazanım hunisi tepsisi aracılığıyla antikor geri kazanım tüplerine (gelecekteki deneyler için antikorun geri kazanılması isteniyorsa) huni haline getirilebilir. Bu benzersiz dağıtım sistemi ile antikorlar herhangi bir sabit borudan geçmez ve potansiyel çapraz kontaminasyonu en aza indirir.

Bandmate işlemci, inkübasyon ve yıkama adımları sırasında tutarlı bir sallanma hareketi sağlar. Benzersiz kavisli inkübasyon tepsileri ile birleştirilmiş sallanma hareketi, gerekli antikor hacimlerini en aza indirmeye yardımcı olur.

Bandmate işlemci, gece boyunca oda sıcaklığında veya soğuk bir odada çalışacak şekilde ayarlanabilir. Kolaylık sağlamak için, son yıkama tamponu işleme tepsisinde tutulur ve sallanma hareketi korunur, böylece siz hazır olur olmaz blotlar doygun ve algılama adımı için hazır kalır. Bandmate işlemci, aynı anda 4 mini blot veya 2 midi blot işlemek için gereken her şeyle birlikte gelir. 

Daha fazla bilgi için tıklayınız.