SuperScript™ IV Reverse Transcriptase

• Yüksek verimli – 100 kata kadar daha yüksek cDNA verimi
• RT-qPCR için 8 döngü kadar azaltılmış süper hassas-Ct değerleri
• Degrede veya inhibitör içeren RNA örneklerinden bile süper sağlam kopyalar
• Süper hızlı–10 dk reaksiyon süresi

Düşük Miktarda veya Degrede RNA'nın Verimli Ters Transkripsiyonu

Verimli bir RT, düşük miktarda veya bozulmuş olanlar da dahil olmak üzere en zor RNA türlerini bile tersine kopyalayacaktır. SuperScript IV RT çok sağlam ve verimlidir ve bozulmuş RNA ile piyasada bulunan diğer RT'lerden 100 kata kadar daha yüksek cDNA verimi sağlayabilir. SuperScript IV RT, her tür RNA ile cDNA sentezi için üstün bir seçimdir ve bozulmuş veya sınırlı RNA için benzersiz bir çözümü temsil eder.

Degrede RNA ile yüksek verimlilik. Farklı RT'ler ve Applied Biosystems™ TaqMan® Testleri ile insan hücreleri ve bitki dokularından alınan bozulmuş RNA'nın RT-qPCR'si (RNA bütünlük numarası (RIN) 1-3). Delta Ct değerleri (∆Ct = Ct – Ct SuperScript IV), SuperScript IV RT'nin standart 10 dakikalık protokolüyle, SuperScript III reaktifi ve diğer tedarikçilerin RT'leri için önerilen protokollerden daha yüksek cDNA verimi ve daha düşük Ct değerleri sağladığını göstermektedir.

SuperScript™ IV Ters Transkriptazın özellikleri şunları içerir:

• cDNA sentezine müdahale edebilen çeşitli inhibitörlere karşı önemli ölçüde geliştirilmiş direnç
• Çok çeşitli numune türlerinde sağlam ve spesifik cDNA sentezi
• İnkübasyon süresini >50 dakikadan 10 dakikaya indiren daha hızlı bir ters transkriptaz reaksiyonu
• SuperScript™ III RT ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha iyi işlenebilirlik

Zorlu RNA Örnekleriyle Artan Hassasiyet ve Tekrarlanabilirlik

CDNA tabanlı deneylerde en yüksek güvenilirlik için, RT'ler yüksek reaksiyon duyarlılığı ve düşük değişkenlik sunmalıdır. Örneğin, üç farklı miktarda bozulmuş RNA girişi ve farklı RT'ler ile üçlü RT-qPCR reaksiyonları gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar, SuperScript IV RT'nin, piyasada bulunan diğer RT'lerle karşılaştırıldığında en düşük Ct değerleri (8 döngü kadar azaltılmış) ve en düşük standart sapmalarla sonuçlandığını göstermektedir. 

Zorlu RNA örnekleri kullanılarak hassas ve tekrarlanabilir cDNA sentezi. Ürün protokolüne göre rastgele heksamerlerle 20 μL SuperScript IV RT reaksiyonlarında 1-100 ng miktarlarında bozulmuş Arabidopsis toplam RNA'sı (RIN: 1-3) kullanıldı. Diğer satıcıların RT'leri, üreticilerin tavsiye ettiği protokollere göre kullanıldı. Her RT enzimi için, her giriş RNA'sı için üç ters transkripsiyon reaksiyonu gerçekleştirildi. Her bir ters transkripsiyon reaksiyonundan, iki hedef, Gln sentetaz ve WRKY TF 70 için TaqMan Testlerine cDNA ürününün %10'u eklendi. Her bir ters transkripsiyon reaksiyonu için üç qPCR reaksiyonu gerçekleştirildi ve her RNA girişi için ortalama Ct değerleri çizildi ( her giriş RNA'sı için 9 Ct değerinden standart sapma).

İnhibitörlerin Varlığında Sağlam Transkripsiyon

RT'ler üzerinde engelleyici etkileri olan çok sayıda bileşik, kapsamlı saflaştırma yöntemleri uygulandıktan sonra bile RNA örneklerinde yaygın olarak bulunur. Bu bileşikler cDNA sentezine müdahale edebilir, yanlış RT-PCR ve RT-qPCR sonuçlarına neden olabilir ve deney sisteminin yanlış yorumlanmasına neden olabilir. RT inhibitörleri, RNA ekstraksiyonu sırasında kullanılan reaktifleri ve biyolojik numunelerden kaynaklanan birlikte saflaştırılmış kirleticileri içerir. SuperScript IV RT, Invitrogen SuperScript III ve piyasada bulunan diğer RT'lere göre kirletici inhibitörlere karşı önemli ölçüde daha iyi direnç gösterir.

Biyolojik veya numune hazırlama inhibitörlerinin varlığında cDNA sentezinde daha yüksek performans. Ürün protokolüne göre oligo(dT)20 ile 10 μL SuperScript IV RT reaksiyonunda 0,5–10 kb RNA merdiveni kullanıldı. Diğer satıcıların RT'leri, ilgili önerilen protokollere göre kullanıldı. Primer tavlamadan veya RT reaksiyon karışımının eklenmesinden önce RNA örneklerine inhibitörler eklendi. Birinci iplikli cDNA'lar, alkalin jel elektroforezi ile çözüldü ve cDNA, Invitrogen SYBR Altın Nükleik Asit Jel Boyası kullanılarak boyandı. Elektroforez sırasında NaOH, tüm RNA'yı hidrolize eder ve yalnızca cDNA'nın görselleştirilmesiyle sonuçlanır.

SuperScript™ IV Reverse Transcriptase

Sadece 10 Dakikada cDNA Sentezi

SuperScript IV RT, uzun, tam uzunlukta cDNA fragmanları oluşturmak için cDNA sentezini hızla gerçekleştirebilen, oldukça işlemsel bir enzimdir. Şekilde, SuperScript IV RT'nin 9 kb'ye kadar cDNA'ları sadece 10 dakikada sentezlediğini gösterirken, piyasada bulunan diğer RT'lerin çoğu aynı süre içinde yalnızca 1.5–3 kb veya daha az cDNA'ları sentezleyebilmiştir.

Hızlı cDNA sentez yeteneği. Invitrogen Millennium RNA Marker, ürün protokolüne göre oligo(dT) ile 10 uL SuperScript IV RT reaksiyonunda kullanıldı. Reaksiyon sürelerinin 10 dakikaya düşürülmesi dışında, ilgili önerilen protokollere göre alternatif RT'ler kullanıldı. Birinci iplikli cDNA'lar alkalin jel elektroforezi ile çözüldü ve cDNA, SYBR Altın Nükleik Asit Jel Boyası kullanılarak boyandı. Elektroforez sırasında NaOH, tüm RNA'yı hidrolize eder ve yalnızca cDNA'nın görselleştirilmesiyle sonuçlanır.

Ters Transkriptaz ile Yüksek Termostabilite

Özellikle GC açısından zengin şablonlarla RNA ikincil yapıları, özellikle reaksiyon düşük sıcaklıklarda (42°C'den düşük) gerçekleştirilirse cDNA sentezine müdahale edebilir. SuperScript IV RT, yüksek termostabiliteye sahiptir ve 50°C veya daha yüksek sıcaklıklardaki reaksiyonlarda kullanılabilir, bu da yüksek düzeyde yapılandırılmış RNA transkriptlerinin bile başarılı transkripsiyonunun sağlanmasına yardımcı olur.

SuperScript IV RT'nin yüksek termostabilitesi. Ürün protokolüne göre oligo(dT) ile 10 μL SuperScript IV RT reaksiyonunda 0,5–10 kb RNA merdiveni kullanıldı, ancak reaksiyon sıcaklığının 50 ila 65°C arasında değişmesi dışında. Birinci iplikli cDNA'lar alkalin jel elektroforezi ile çözüldü ve cDNA, SYBR Altın Nükleik Asit Jel Boyası kullanılarak boyandı. Elektroforez sırasında NaOH, tüm RNA'yı hidrolize eder ve yalnızca cDNA'nın görselleştirilmesiyle sonuçlanır. cDNA bantları, her reaksiyon sıcaklığı için TotalLab yazılımı ile nicelendirildi. SuperScript IV RT aktivitesinin yüzdesi, her reaksiyon sıcaklığındaki değerlerin 50°C'deki değerlere bölünmesiyle hesaplandı.

Kaynak

• M-MLV'nin pol genini eksprese eden E. coli'den saflaştırılmış, termostabiliteyi ve yarı ömrü, prosesi, inhibitör direncini artırmak ve RNase H aktivitesini azaltmak için modifiye edilmiştir.

Performans ve Kalite Testi

• Endodeoksiribonükleaz, eksodeoksiribonükleaz ve ribonükleaz deneyleri; ve cDNA ürününün verimi ve uzunluğu.

Birim Tanımı

• Bir birim SuperScript® IV RT, bir şablon/primer olarak poli(A) oligo(dT)12-18 kullanılarak 37°C'de 10 dakikada asitle çökeltilebilen malzemeye 1 nmol deoksiribonükleotidi dahil etmek için gereken enzim miktarıdır.

Birim Reaksiyon Koşulları

• 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 4 mM MgCl2, 10 mM DTT, 50 mM KCl, 0.5 mM dTTP, 0.4 MBq/mL [3H]-dTTP, 0.4 mM poli(A) oligo (dT)12-18 ve 37°C'de 10 dakika boyunca 20 µl içinde enzim.
   

İçerik&Saklama Koşulları

• SuperScript™ IV RT (200 U/µL'de toplam 2.000 birim), 10 µL
• 5X RT tamponu, 1 mL
• 0.1 M DTT, 500 µL
• -5 ila -30°C'de saklayın