Yüksek RT-qPCR Veri Tekrarlanabilirliği ve Doğruluğu

1. SuperScript IV VILO Master Mix, önceden karıştırılmış formülasyondaki tüm reaksiyon bileşenlerini içerir. Reaksiyon karışımını tamamlamak için yalnızca RNA şablonunu ve suyu eklemeniz gerekir. Bu hepsi bir arada formatla pipetleme adımları en aza indirilir ve bu da RT-qPCR verilerinin tekrar üretilebilirliğini iyileştirmeye ve kontaminasyonu önlemeye yardımcı olur.
2. SuperScript IV VILO Master Mix RT No-RT kontrolü (RT enzimi olmayan tüm ana karışım bileşenleri), potansiyel gDNA kontaminasyonunun boyutunu izlemenize ve yanıltıcı sonuçlardan kaçınmanıza olanak tanır.
3. ezDNase, yüksek RNA kalitesini ve RT-qPCR veri doğruluğunu korurken kirletici gDNA'yı ortadan kaldırır.

Genişletilmiş RNA Girişi Aralığında Güvenilir Performans

SuperScript IV VILO Master Mix, en geniş RNA girişi aralığında üstün hassasiyet ve genişletilmiş doğrusallık için SuperScript IV RT ve RNA şablonu arasındaki etkileşimi geliştiren tescilli yardımcı protein içerir.

RT-qPCR'nin RT adımındaki mükemmel doğrusallık, şunları yapacağınız anlamına gelir:

• Bolluğuna bakılmaksızın cDNA'nızda aynı nispi hedef RNA temsilini elde edin
• İlgilendiğiniz hedef ve referans hedef için başlangıç materyali miktarı farklı olsa bile veri normalleştirmesini doğru şekilde gerçekleştirin
• Bu yaygın önyargıyı azaltarak RT-qPCR verilerinizde daha fazla doğruluk elde edin

Bir dizi RNA girişi için 10 büyüklük sırası boyunca genişletilmiş doğrusallık. HeLa hücrelerinden toplam RNA'nın seri dilüsyonları, SuperScript IV VILO Master Mix kullanılarak ters kopyalandı, ardından Invitrogen EXPRESS qPCR SuperMix Universal ile 18S rRNA için insan TaqMan testi kullanılarak qPCR reaksiyonları yapıldı. 1 fg'den 1 μg'ye kadar geniş bir RNA girişi aralığında bile, ana karışım 0,999'luk bir korelasyon katsayısı ve %94,2'lik yüksek verimlilik sergiler. Amplifikasyon grafiği, geniş bir lineer RNA girişi aralığı üzerinden SuperScript IV VILO Master Mix'in sağlam yapısını gösterir. Bu, farklı RNA giriş seviyelerinde potansiyel RT verimliliği varyasyonu hakkında endişelenmeden daha düşük bolluklu genlerinizi referans genlerinize normalleştirebileceğiniz anlamına gelir.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4 Kat Daha Fazla cDNA, 2 Döngü Daha Düşük Ct Değerleri

Diğer RT reaktiflerine kıyasla ortalama 2 döngü daha erken Ct değerleri

Düşük başlangıç RNA girişi kullanan çok çeşitli hedef transkriptlerin RT-qPCR analizinde, SuperScript IV VILO Master Mix, diğer 8 cDNA sentez reaktifine kıyasla daha yüksek cDNA verimi ve daha düşük Ct değerleri sağlayarak en yüksek verimliliği sağlar.

RT-qPCR uygulamalarında daha yüksek cDNA sentez verimliliği şunları yapabileceğiniz anlamına gelir:

• Gelecekteki çalışmalar için cDNA'yı arşivleyin
• Düşük RNA girişi, düşük kopyalı hedefler veya bozulmuş RNA ile çalışmak için daha iyi RT-qPCR hassasiyeti elde edin
• RT-qPCR iş akışınızda daha az RNA girişi kullanın

Geniş bir hedef yelpazesinde en yüksek verimlilik. cDNA sentezi, 1 ng toplam HeLa RNA girişi kullanılarak, üretici talimatlarına göre farklı ana karışımlarla gerçekleştirildi. qPCR, belirtilen gen hedefleri için Invitrogen EXPRESS qPCR SuperMix ve Applied Biosystems TaqMan primeri ve/veya probları ile gerçekleştirilmiştir. Delta Ct değerleri (∆Ct= Ct – CtSuperScript IV VILO), SuperScript IV VILO Master Mix'in test edilen diğer reaktiflerden en yüksek cDNA verimini ve ortalama 2 döngüde daha düşük Ct değerleri sağladığını gösterir.

 

 

Zorlu RNA'larla Güvenilir Performans

qPCR için birçok cDNA sentez ürünü, yalnızca ideal, bozulmamış RNA örnekleriyle en iyi şekilde çalışır, ancak yetersiz RNA'larla tehdit edildiğinde başarısız olur. Degrede veya inhibitör içeren RNA ile bile sağlam SuperScript IV VILO Master Mix üstün performans sunar.
 

İnhibitör içeren RNA ile üstün performans. Farklı inhibitörler içeren reaksiyonlarda 100 ng toplam HeLa kullanılarak cDNA sentezi gerçekleştirilmiştir. qPCR, EXPRESS qPCR SuperMix kullanılarak B2M gen hedefi için TaqMan primer/probları ile gerçekleştirildi. Delta Ct değerleri (∆Ct= Ct – CtSuperScript IV VILO), SuperScript IV VILO Master Mix'in tüm reaksiyon inhibitörlerinin varlığında en yüksek cDNA verimini ve en düşük Ct değerlerini sağladığını gösterir.

Degrede RNA ile üstün performans. cDNA sentezi, donmuş akciğer dokusundan 50 ng bozulmuş (RIN<5) RNA kullanılarak gerçekleştirilmiştir. qPCR, EXPRESS qPCR SuperMix kullanılarak farklı gen hedefleri için TaqMan primer/probları ile gerçekleştirildi. Delta Ct değerleri (∆Ct= Ct – CtSuperScript IV VILO), SuperScript IV VILO Master Mix'in bozulmuş RNA ile en yüksek cDNA verimini ve en düşük Ct değerlerini sağladığını gösterir.

 

 

 

 

 

 

 

 

Hızlı, Kolay ve RNA Dostu gDNA Giderme

Sütun üzerinde DNAz sindirimine sahip protokoller de dahil olmak üzere tüm RNA saflaştırma yöntemleri, gDNA'yı tamamen çıkarmada başarısız olur. Kirletici gDNA'nın amplifikasyonu, özellikle zayıf eksprese edilmiş genleri tespit ederken, Ct değerlerinde bir kaymaya neden olabilir. DNase I enzimi, gDNA'yı RNA'dan çıkarmak için yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, DNase I, primerler ve cDNA gibi tek sarmallı DNA'yı bozabilir ve bu nedenle cDNA sentezinden önce etkisiz hale getirilmesi veya çıkarılması gerekir. Bu genellikle EDTA veya RNA verimine zarar verebilecek veya azaltabilecek diğer işlemler kullanılarak yapılır.

Çift sarmallı DNA'ya özgü Invitrogen ezDNase enzimli SuperScript IV VILO Master Mix, verimli, hızlı ve kolay gDNA eliminasyonuna izin verir (37°C'de 2 dakika). ezDNase termolabil olduğundan, standart SuperScript IV RT cDNA sentez sıcaklığında (50°C) inaktive edilir, ayrı bir inaktivasyon adımına olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve RT-qPCR sonuçlarında en yüksek doğruluk ve güveni sağlar.

DNase I ve ezDNase ile gDNA çıkarılmasının Ct değerlerine etkisi. HeLa total RNA, ezDNase veya DNase I enzimleri ile muamele edildi. ezDNase enzimi ile tedavi edilen numuneler hemen RT-qPCR için işlenirken, DNase I ile tedavi edilen numuneler ilk önce standart protokollere göre EDTA varlığında DNase I inaktivasyonu için işlendi. Her iki RNA numunesi, SuperScript IV VILO Master Mix ve TaqMan 18S rRNA tahlili ile seri olarak çift RT-qPCR reaksiyonlarına seyreltildi. DNase I ile tedavi, daha sonra Ct değerleriyle sonuçlandı (ortalama olarak 0,5 döngü), bu da DNase I tedavisinin ve inaktivasyonunun RNA bütünlüğünü ve/veya verimlerini etkilediğini (düşürdüğünü) düşündürdü.

ezDNase ile gDNA dekontaminasyonunu tamamlayın. 100 ng insan gDNA'sı, 250 ng HeLa toplam RNA ile karıştırıldı. SuperScript IV VILO Master Mix ve gDNA hedefine özgü qPCR testleri ile üç farklı reaksiyon gerçekleştirilmiştir: RT-qPCR, qPCR ve qPCR, ezDNase ile 37°C'de 2 dakika tedaviyi içermektedir. ezDNase, gDNA'yı etkili bir şekilde uzaklaştırdı ve hiçbir hedef amplifikasyonu ile sonuçlanmadı.

 

SuperScript™ IV VILO™ Master Mix
SuperScript™ IV VILO™ Master Mix- ezDNase™ Enzimi ile

• Sadece 10 dakikada süper hızlı RT reaksiyonu ve 2 dakikada gDNA kaldırma
• Süper yüksek verimler—diğer tüm ters transkripsiyon reaktiflerinden 2 döngüden fazla daha düşük Ct değerleri
• İki aşamalı RT-qPCR için süper kullanışlı tek tüplü cDNA reaksiyon ana karışımı
• Düşük şablon miktarları ve optimal olmayan saflık örnekleri ile bile süper verimli reaksiyon

Daha da iyi performans için, SuperScript IV VILO Master Mix, RT-qPCR iş akışını daha da hızlandırmak için genomik DNA çıkarılması için ezDNase (ayrıca satın alınabilir) içerir. Son derece basitleştirilmiş genomik DNA çıkarma adımı, tüm ters transkripsiyon protokolünün süresini önemli ölçüde azaltır ve geleneksel DNaz tedavisi sırasında RNA kaybı veya hasarı nedeniyle gen ekspresyonundaki olası varyasyonu azaltır.

SSIV VILO ana karışımı, RT-qPCR için diğer tüm cDNA sentez kitlerinden veya ana karışımlarından daha az pipetleme, daha az varyasyon, daha az reaksiyon inhibisyonu, daha az gDNA paraziti ve daha az numune ile size daha kısa sürede daha fazla cDNA verir.

• Kaynak

  M-MLV'nin pol genini eksprese eden E. coli'den saflaştırılmış, termostabiliteyi ve yarı ömrü, prosesi, inhibitör direncini artırmak ve RNase H aktivitesini azaltmak için modifiye edilmiştir.

• Performans ve Kalite Testi

Endodeoksiribonükleaz, eksodeoksiribonükleaz ve ribonükleazın yanı sıra cDNA ürününün verimi ve uzunluğu için test edilmiştir.

ezDNase™ Enzimi

Invitrogen™ ezDNase™ Enzim, kontamine edici genomik DNA'nın RNA preparatlarından hızlı bir şekilde çıkarılması için rekombinant çift zincire özgü bir DNase'dir. Çift sarmallı DNA'daki fosfodiester bağlarını keserek 5'-fosfat ve 3'-hidroksil uçlarına sahip 2-8 bp oligonükleotitler verir.

ezDNase Enzim'in özellikleri şunları içerir:

• Verimli ve hızlı genomik DNA çıkarma
• Son derece spesifik—RT reaksiyonlarında RNA, cDNA veya primerler üzerinde etkisi yoktur

ezDNase Enzyme'in çift sarmallı DNA için yüksek özgüllüğü, cDNA ve primerler gibi reaksiyonda bulunan RNA veya tek sarmallı DNA'nın kalitesinde veya miktarında azalma olmaksızın verimli ve hızlı genomik DNA çıkarılmasını sağlar. ezDNase Enzyme ısıya dayanıklıdır ve bu nedenle orta sıcaklıkta (55°C) ısıl işlemle kolayca devre dışı bırakılabilir. Bu özellikler, ezDNase'i ters transkripsiyon reaksiyonlarından önce genomik DNA'nın çıkarılması için üstün bir seçim haline getirir.












SuperScript™ IV VILO™ Master Mix veya diğer Invitrogen ters transkripsiyon reaktifleri ile birlikte kullanıldığında ezDNase Enzimi, cDNA sentezinin genomik DNA tarafından tehlikeye atılma olasılığını önemli ölçüde azaltmaya yardımcı olur ve geleneksel DNase tedavisi sırasında RNA kaybı veya hasarının neden olduğu RT qPCR nicelemesindeki varyasyonu azaltır.

Önemli Ölçüde Basitleştirilmiş İş Akışı

SuperScript IV RT'nin SuperScript IV VILO Master Mix'teki yüksek işlenebilirliği nedeniyle, cDNA sentez reaksiyonları, geleneksel RT enzimleriyle gerçekleştirilen reaksiyonlara (60 dakika) kıyasla önemli ölçüde daha hızlıdır (10 dakika). Ek olarak, ezDNase ile gDNA uzaklaştırma protokolü sadece 2 dakika sürer ve ayrı bir enzim inaktivasyon adımı gerektirmez. SuperScript IV VILO Master Mix ile cDNA sentezi ve gDNA kaldırma iş akışı bu nedenle geleneksel sistemlerden çok daha kısadır.



Daha fazla bilgi için tıklayınız.