HPLC Analizlerinde İyi Pik Şekilleri Elde Etmek için İpuçları

Genel olarak, kromatografide keskin pikler tercih edilir, çünkü yayvan pikler kolayca birbiriyle çakışabilir. Ayrıca, pik alanı konsantrasyonla orantılı olduğundan, pik ne kadar dar olursa, tepe noktası da o kadar yüksek olur. Bu, hassasiyet açısından önemlidir.

1-1. Örnek Adsorpsiyonunu En Az İndirgemek
Analitler dolgu maddesi üzerine adsorbe edildiğinde, pik şekilleri kötüleşir ve çoğunlukla asimetrik hale gelir. Böyle bir durum oluştuğu takdirde, end capped bir kolon kullanmak gibi önlemler almak gerekir.



Şekil 1-1. Metal bir şelatöre ait elüsyonunun karşılaştırılması


Şekil 2-2. Ana adsorpsiyon sebepleri.

Sebep 1: Elektrostatik Etkileşim Yoluyla Adsorpsiyon

İyonik fonksiyonel gruplar, örneğin silanol grupları SiO, dolgu maddesi üzerinde kaldığında, elektrostatik etkileşim gerçekleşebilir. Bu ters faz modunda meydana gelirse, pik şeklinin bozulmasına neden olabilir.

Sebep 2: Metal Koordinasyonu ile Adsorpsiyon
Metallerin dolgu silikasına eklenmesi, numunede bulunan metal şelatörlerin adsorpsiyonuna yol açabilir. Bu adsorpsiyon zaman zaman hedef bileşiklerin elüsyonuna engel olabilir.

1-2. Küçük Partiküllerin Seçilmesi
Daha küçük partiküller, aynı dolgu maddesi için bile, daha yüksek kolon verimliliği sağlar. Ancak, daha küçük partiküllerin daha yüksek kolon basıncı oluşturduğu unutulmamalıdır. Bu nedenle sistemin basınç direncinin kontrol altında olması önemlidir.
 

Şekil 1-3. Doğrusal hız ve kolon basıncı arasındaki ilişki.

1-3. Akış Hızının Etkisi
Pik genişlikleri, hareketli fazın doğrusal hızına bağlıdır ve her bir kolon için bir optimal hız bulunur. Keskin pikler elde etmek için, optimuma yakın bir doğrusal hız sağlayan bir akış hızının uygulanması istenir.

Şekil 1-4. ODS kolonların Van Deemter eğrileri

1-4. Ölü Hacmi En Aza İndirmek

Tubing ve kolon arasında bir ölü hacim varsa, pikler bozulur. Bu aynı zamanda tubingin kolona olan bağıl hacmi büyük olduğunda da olur. Küçük iç çapa sahip kolonlar (ID) veya kısa kolonlar kolayca etkilenir. Ölü hacmin etkisini azaltmak için, uzun kolonların kullanılması bir çözümdür. Şekil 1-7, 2 µm partikül boyutlu 50 mm uzunluğunda bir kolon ile 3 µm partikül boyutlu 75 mm uzunluğunda bir kolon arasındaki bir karşılaştırmayı gösterir. Daha uzun kolon uzunluğu, daha büyük partiküllü kolonlarla bile daha iyi pikler elde edilmesinin nedeni ölü hacmin etkisinin azalmış olmasıdır.



Şekil 1-5. Ölü hacmin pik şekilleri uzunluğunun etkisi.     Şekil 1-6. I.D. ve bağlantı tubing’inin üzerine etkisi.

Şekil 1-7. 2µm ve 3µm’lik partüküller arasında karşılaştırma.

1-5. Silika partiküllerin gözenek büyüklüğü
5 000'den daha büyük bir moleküler ağırlığa sahip bileşikler için, bazen iyi pik şekilleri elde etmek için geniş gözeneklere sahip partiküllerin kullanılması gerekir. Örneğin, Inertsil WP 300 C 18 bu bileşikler için iyi bir seçenektir.

1-6. Hızlı Elüsyon
Genel olarak, enjeksiyondan dedektöre kadar geçen süre daha uzun sürdükçe analitler daha fazla yayılırlar ve bu daha yayvan pik şekillerine neden olur. Bu nedenle, hassasiyet, kısa analizi mümkün kılan analitik koşullar benimsenerek iyileştirilebilir. Kolon kalıcılığını arttırmak, kolon uzunluğunu kısaltmak ve mobil faz kompozisyonunu değiştirmek bu yöntemler arasındadır. Bununla birlikte, bu yöntemlerin ayrımı kötüleştirebileceği unutulmamalıdır.

Şekil 1-8. Kolon kalıcılığını azaltarak daha kısa analiz sonuçları.

1-7. Numune Solventinin Bileşimi
Numune solventin ile mobil faz arasında bir uyumsuzluk varsa, pik şekilleri bozulabilir. Çünkü numune solventi enjeksiyondan hemen sonra mobil faz olarak çalışır. Bu, numune solventi daha yüksek elüsyon gücüne sahip olduğunda pik şekilleri üzerinde önemli bir etkiye sahip olmaktadır. Bu durumda, numune solventinin bileşiminin veya enjeksiyon hacminin değiştirilmesi pik şekillerini geliştirebilir.


Şekil 1-9. Numune solventinin bileşiminde yapılan değişikliklerle pik şekillerinin iyileştirilmesi


Ref: https://www.glsciences.com/technique/technique_data/lc/usage_of_hplc_1/column1.html