Western Blot nedir?

Western blot, protein biyolojisi, immünogenetik, moleküler biyoloji gibi alanlarda protein solüsyonu içerisinde protein saptama ve spesifik proteinlerin tanımlanmasında yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir.
Western blot tekniği, antikor tespitinin özgüllüğü ile jel elektroforezinin rezolüsyonunu bir araya getiren bir yöntemdir.
 

Western Blot Aşamaları

1-Örnek hazırlama
2-Jel elektroforez
3- Proteinlerin membrana transferi
4-Antikor inkübasyonu
5-Görüntüleme ve analiz
 

Western Blot nasıl uygulanır?

Western blot prosedüründeki ilk adım numuneyi hazırlamaktır. Daha sonra, jel elektroforezi kullanarak bir numunedeki makromoleküller ayırılır. Ardından, ayrılan moleküller, genellikle bir nitroselüloz veya poliviniliden diflorür (PVDF) zarı olan ikinci bir matris üzerine aktarılır veya lekelenir. Daha sonra, antikorların zarın yüzeyine herhangi bir spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için zar bloke edilir.

En yaygın olarak, aktarılan protein daha sonra bir antikor kombinasyonu ile problanır: ilgilenilen proteine ​​özel bir antikor (birincil antikor) ve birincil antikorun konakçı türüne özgü başka bir antikor (ikincil antikor). Genellikle ikincil antikor, uygun bir substrat ile birleştirildiğinde saptanabilir bir sinyal üretecek olan bir enzim ile kompleks oluşturur. Kromojenik substratlar, zar üzerinde gözle görülebilen kolorimetrik değişikliklerle sonuçlanan bir çökelti üretir. En hassas tespit yöntemleri, antikora konjuge enzim ile reaksiyonun bir yan ürünü olarak ışık üreten bir kemilüminesan substrat kullanır. Işık çıkışı film kullanılarak yakalanabilir. Bununla birlikte, şarj bağlantılı cihaz (CCD) kameralarına dayalı dijital görüntüleme cihazları, kemilüminesan sinyali yakalamak için filme popüler alternatifler haline geliyor. Alternatif olarak, floresan sinyali yakalayabilen bir alet kullanılarak tespit gerektiren floresan etiketli antikorlar kullanılabilir. Floresan lekeleme daha yeni bir tekniktir ve çoğullama (tek bir leke üzerinde birden fazla proteini tespit etme) potansiyeli sağladığı için popülaritesi artmaktadır. Hangi sistem kullanılırsa kullanılsın, sinyalin yoğunluğu, zar üzerindeki antijenin bolluğu ile ilişkili olmalıdır.
 

 
Bir western blot deneyinin saptama aşaması için prosedürler büyük ölçüde değişiklik gösterir. Yaygın bir varyasyon, doğrudan ve dolaylı algılamayı içerir. Doğrudan saptama yöntemiyle, leke üzerinde ilgilenilen antijeni saptamak için bir enzim veya floroforla konjuge birincil antikor kullanılır. Çoğu araştırmacı çeşitli nedenlerle dolaylı tespit yöntemini tercih ettiğinden bu tespit yöntemi yaygın olarak kullanılmamaktadır. Dolaylı saptama yönteminde, antijene bağlanmak için ilk olarak etiketlenmemiş bir birincil antikor kullanılır. Ardından, birincil antikor, bir enzim veya floroforla konjuge ikincil antikor kullanılarak saptanır. Etiketler (veya konjuge moleküller) biotin, Invitrogen Alexa Flour veya DyLight floroforları gibi floresan probları ve yaban turpu peroksidaz (HRP) veya alkalin fosfataz (AP) gibi enzim konjugatlarını içerebilir. Dolaylı yöntem, aşağıda açıklanan doğrudan yönteme göre birçok avantaj sunar.

Protein Tanımlama

 Protein tanımlanması membran üzerinde özgül bağlamaları tespit etmek için sekonder antikora konjuge enzimle reaksiyona girerek sinyal oluşturacak substratlar kullanılmaktadır.













 

1-Kolorimetrik Tanımlama

2- Kemilüminesan Tanımlama

Kemilüminesans ya da kimyasal ışıldama, madde içinde gerçekleşen kimyasal reaksiyon sonucu çok az miktarda ısıl ışıma ve ışık ışıması durumudur. Western Blot’da ikincil antikora bağlı olan enzime özgü substrat ortama konulduu zaman ışıma meydana gelir.

3- Floresan Tanımlama

Floresan tanımlama yönteminde ikincil antikor flurescein, texas red, phycoerythrin gibi floresan bir maker ile bağlanmıştır. Bu yöntemde floresan ışımanın tanımlanması için ek bir görüntüleme sistemine ihtiyaç duyulmaktadır.